western blot

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    暖暖岁月 发布于:2016.08.31

    您好,我目前还没有悬赏金,刚注册的,请谅解。

    我初学者刚做Western blot,遇到很多问题。请大家不吝赐教……我的载体是pET32a,载体上面包含2个His-tag。我的蛋白条带大小为10.5kd,载体上含有蛋白大小为19kd。我做western时:一抗1h,浓度为1:5000;二抗1h,浓度为1:20000.封闭时间为1h。上样量:蛋白6ul,marker3ul,电泳90min。

      我用的一抗是:6His.His-tag mouse McAb。  一抗和二抗都是师姐留下来的,我不知道western的一抗、二抗都是通用的还是有选择性的……请大家帮我指导一下,怎么改进自己的实验,是换一抗还是怎么回事?一抗怎么选择啊,根据自己的载体么?


     
    2条评论 370浏览 邀请回答

    鸿鹄 回答于:2016年09月01日 22:40:431楼

     中国药科大 中药学院 药理学 博士 

    一抗能用单克隆尽量用单克隆,其实目前多克隆用得也没问题,还有考虑适用性(WB/IHC/IF),可以参考抗体引用文献作为参考;二抗根据一抗的源性考虑,一抗是鼠的,二抗就用羊抗鼠的,一抗二抗源性要一致。(但不排除特异性问题,我们实验偶然用羊抗兔的也能爆出一抗是鼠的蛋白)。

    轻舞飘扬 回答于:2016年09月01日 23:10:572楼

     山东大学 生命科学学院 分子生物学 本科 

    你这个载体诱导表达之后的两个蛋白不是融合蛋白吧?也就是诱导表达之后就是20kd和10kd的两个蛋白吧。如果是这样,你的诱导系统应该没啥问题,主要是western blot问题。你上样量感觉有点多了,相邻两个条带都连在一起了。


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