病毒载体

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  • 请教载体

    狼牙 发布于:2016.08.15

    hello,请教一下病毒载体与其他的载体有什么不同,病毒载体的不同元件代表的意思?已经元件的翻译顺序。比如:U6-MCS-Ubi-EGFP-IRES-puromycin。这个元件的EGFP的表达受不受U6的调节?

     
    5条评论 508浏览 邀请回答

    野口英世·生 回答于:2016年08月17日 16:53:241楼

     中国协和医科大学 医药生物技术研究所 临床检验诊断学 博士 

    一般载体分为病毒载体和非病毒载体两大类,其中常用的病毒载体有腺病毒载体(AdV),腺相关病毒

    载体(AAV),逆转录病毒载体等。

    AdV是一种中等大小、无包膜,具有核衣壳的线性双链DNA病毒,可在哺乳动物胞核复制,但不整合到宿

    主细胞基因组,缺点:AdV存在较大的免疫原性,多次注射可刺激机体产生强烈的免疫反应,限制了其

    应用;AAV载体是一种结构简单的单链DNA缺陷病毒,对野生型AAV改造后获得的重组AAV(rAAV)载体安

    全性好、宿主范围广、免疫原性较低,缺点:rAAV复制需要AdV等辅助病毒参与,制备过程繁琐,且胞

    内表达外源性基因水平不高;逆转录病毒载体以慢病毒(LV)载体多见,免疫原性较小、宿主范围广,

    尤其对于非分裂细胞,如中枢神经系统、血液系统细胞等有较高的转染效率,缺点:此类逆转录病毒载

    体均属于RNA病毒,存在高突变的特性,由于其易整合到宿主细胞基因组,存在潜在的致癌性;

    常用的非病毒载体包括脂质体和纳米粒子。脂质体本身缺乏主动靶向性、系统给药毒性大,有潜在的致

    敏性;纳米粒子直径小于100nm的颗粒不易被网状内皮系统清除,有较长的半衰期,且纳米粒子比表面

    积大、水溶性强,易于运输,但其具有一定细胞毒性。


    狼牙同学在问题中所提到的是一个经改造后的慢病毒载体,那我就以这个为例进行下说明哈:


    这是一个在真核细胞表达外源基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体,首先,U6启动子是

    RNA聚合酶III依赖的启动子,MCS为多克隆位点,可以插入要表达的外源基因片段;Ubi是天然的泛素

    启动子,与其他真核启动子类似,均由核心启动子和含有内含子的5'非转录区(5'UTR)组成,与组成

    型启动子不同的是它不含增强序列,在这里Ubi启动表达EGFP;U6启动子启动外源基因片段Ubi启动表

    达EGFP作为两个单独的表达过程同时进行,注意由于U6启动子仅能将外源基因表达至mRNA水平,不能

    翻译表达出蛋白质,而Ubi能启动表达EGFP蛋白,二者相互之间影响较小;IRES(内部核糖体进入位点

    序列),是位于5'端的一段较短的RNA序列(150-250bp),这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结

    构,从而介导核糖体与RNA结合,起始蛋白质翻译,多存在于RNA病毒中,puromycin(嘌呤霉素)即抗

    嘌呤霉素基因,利用载体此抗性可进行转染后细胞筛选,在这里IRES起着分隔符的作用,当EGFP和抗

    嘌呤霉素基因转录后,IRES通过与核糖体的结合将两种蛋白分别翻译出来,保证其正常功能。


    以上即我的理解,不知可否解决狼牙同学的问题,还请各位同学批评指正。:-D


    狼牙 回答于:2016年08月17日 19:18:362楼

     河南科技大学 农学院 生物技术 本科 
    #野口英世·生# 在2016-08-17 16:53:24说到:

    一般载体分为病毒载体和非病毒载体两大类,其中常用的病毒载体有腺病毒载体(AdV),腺相关病毒

    载体(AAV),逆转录病毒载体等。

    AdV是一种中等大小、无包膜,具有核衣壳的线性双链DNA病毒,可在哺乳动物胞核复制,但不整合到宿

    主细胞基因组,缺点:AdV存在较大的免疫原性,多次注射可刺激机体产生强烈的免疫反应,限制了其

    应用;AAV载体是一种结构简单的单链DNA缺陷病毒,对野生型AAV改造后获得的重组AAV(rAAV)载体安

    全性好、宿主范围广、免疫原性较低,缺点:rAAV复制需要AdV等辅助病毒参与,制备过程繁琐,且胞

    内表达外源性基因水平不高;逆转录病毒载体以慢病毒(LV)载体多见,免疫原性较小、宿主范围广,

    尤其对于非分裂细胞,如中枢神经系统、血液系统细胞等有较高的转染效率,缺点:此类逆转录病毒载

    体均属于RNA病毒,存在高突变的特性,由于其易整合到宿主细胞基因组,存在潜在的致癌性;

    常用的非病毒载体包括脂质体和纳米粒子。脂质体本身缺乏主动靶向性、系统给药毒性大,有潜在的致

    敏性;纳米粒子直径小于100nm的颗粒不易被网状内皮系统清除,有较长的半衰期,且纳米粒子比表面

    积大、水溶性强,易于运输,但其具有一定细胞毒性。


    狼牙同学在问题中所提到的是一个经改造后的慢病毒载体,那我就以这个为例进行下说明哈:


    这是一个在真核细胞表达外源基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体,首先,U6启动子是

    RNA聚合酶III依赖的启动子,MCS为多克隆位点,可以插入要表达的外源基因片段;Ubi是天然的泛素

    启动子,与其他真核启动子类似,均由核心启动子和含有内含子的5'非转录区(5'UTR)组成,与组成

    型启动子不同的是它不含增强序列,在这里Ubi启动表达EGFP;U6启动子启动外源基因片段Ubi启动表

    达EGFP作为两个单独的表达过程同时进行,注意由于U6启动子仅能将外源基因表达至mRNA水平,不能

    翻译表达出蛋白质,而Ubi能启动表达EGFP蛋白,二者相互之间影响较小;IRES(内部核糖体进入位点

    序列),是位于5'端的一段较短的RNA序列(150-250bp),这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结

    构,从而介导核糖体与RNA结合,起始蛋白质翻译,多存在于RNA病毒中,puromycin(嘌呤霉素)即抗

    嘌呤霉素基因,利用载体此抗性可进行转染后细胞筛选,在这里IRES起着分隔符的作用,当EGFP和抗

    嘌呤霉素基因转录后,IRES通过与核糖体的结合将两种蛋白分别翻译出来,保证其正常功能。


    以上即我的理解,不知可否解决狼牙同学的问题,还请各位同学批评指正。:-D


    请教一下:

    注意由于U6启动子仅能将外源基因表达至mRNA水平,不能

    翻译表达出蛋白质,

    这个蛋白质如何进行翻译呢?谢谢

    野口英世·生 回答于:2016年08月17日 22:49:393楼

     中国协和医科大学 医药生物技术研究所 临床检验诊断学 博士 

    U6启动子只能将外源基因转录成RNA,不能翻译成蛋白质的;如果你要将插入的外源基因表达到蛋白质水平,就要更换启动子(如CMV等),相应的EGFP的启动子也要更换(如SV40等),前者是强启动子,后者是弱启动子,这样既能保证表达目的蛋白和EGFP,又能尽量降低二者之间影响。:-D

    狼牙 回答于:2016年08月22日 20:23:374楼

     河南科技大学 农学院 生物技术 本科 
    #野口英世·生# 在2016-08-17 22:49:39说到:

    U6启动子只能将外源基因转录成RNA,不能翻译成蛋白质的;如果你要将插入的外源基因表达到蛋白质水平,就要更换启动子(如CMV等),相应的EGFP的启动子也要更换(如SV40等),前者是强启动子,后者是弱启动子,这样既能保证表达目的蛋白和EGFP,又能尽量降低二者之间影响。:-D

    所以说这个载体只是个干扰载体,不能用于过表达,这个RNA与宿主体内的RNA结果,形成RNAI,产生沉默吗?

    野口英世·生 回答于:2016年08月23日 18:14:355楼

     中国协和医科大学 医药生物技术研究所 临床检验诊断学 博士 
    #狼牙# 在2016-08-22 20:23:37说到:

    所以说这个载体只是个干扰载体,不能用于过表达,这个RNA与宿主体内的RNA结果,形成RNAI,产生沉默吗?

    可以这么理解哈,表达蛋白的话还是换下启动子;至于表达的RNA的作用,就要看你构建的目的了哈


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