分子生物学

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  • 克隆构建

    狼牙 发布于:2016.08.15

    hello,请教一下,融合基因如何进行构建呢?比如一个基因后面融合一个EGFP的基因,顺便请教一下Snapgene如何使用呢?谢谢

     
    6条评论 279浏览 邀请回答

    ACC-CAA-TGG 回答于:2016年08月15日 16:03:161楼

    上海 华东理工大学生物工程学院 生化与分子博士 

    融合基因的构建最主要的原则是保证阅读框正确,避免引入多余碱基导致的移码突变;其次在构建的时候可以在载体上找合适的酶切位点,一般专用的融合表达质粒(如报告质粒)都会在融合标签(如EGFP和lacZ)前有一个或多个酶切位点,在PCR获得你的目的序列的时候要注意去除基因本身的终止密码子,防止翻译终止;另外,一般融合表达时会在目的基因和报告基因之间接入6-12个氨基酸来保证前后蛋白结构域之间不会相互影响。

    snapgene是一个专业的查看序列的软件,操作比较简便,但描述起来比较复杂。楼主可以去网上搜索是否有视频教程!

    狼牙 回答于:2016年08月15日 18:08:012楼

     河南科技大学 农学院 生物技术 本科 

    那么EGFP的起始密码子还需要带吗?

    实验狗 回答于:2016年08月15日 18:52:593楼

     北京大学 医学部 免疫学 硕士 
    #狼牙# 在2016-08-15 18:08:01说到:

    那么EGFP的起始密码子还需要带吗?

    基因后面融合一个EGFP,那么你可以采用的是PEGFP-N1这个载体,把你的目的表达基因片段的终止密码子去掉,然后装在多克隆位点上,需要考虑移码突变。还是你是想直接PCR出来一段序列,这段序列是融合了你自己的基因片段以及EGFP的片段,这样的话起始密码子去不去掉都可以

    狼牙 回答于:2016年08月15日 19:35:004楼

     河南科技大学 农学院 生物技术 本科 

    刚刚楼上那位博士师兄说的:一般融合表达时会在目的基因和报告基因之间接入6-12个氨基酸来保证前后蛋白结构域之间不会相互影响。中间插入的氨基酸随便加还是有特定的序列加进来呢?还想问一下U6-MCS-Ubi-EGFP-IRES-puromycin,譬如这个元件顺序,目的基因的表达与EGFP质检有什么影响关系吗?这个序列如何进行?谢谢

    ACC-CAA-TGG 回答于:2016年08月15日 23:25:505楼

    上海 华东理工大学生物工程学院 生化与分子博士 
    #狼牙# 在2016-08-15 19:35:00说到:

    刚刚楼上那位博士师兄说的:一般融合表达时会在目的基因和报告基因之间接入6-12个氨基酸来保证前后蛋白结构域之间不会相互影响。中间插入的氨基酸随便加还是有特定的序列加进来呢?还想问一下U6-MCS-Ubi-EGFP-IRES-puromycin,譬如这个元件顺序,目的基因的表达与EGFP质检有什么影响关系吗?这个序列如何进行?谢谢

    一般来说在你所选择插入外源的一对限制性内切酶位点中的下游酶切位点距离报告基因起始本身会多出10-20个碱基,其翻译形成的Linker足够避免相邻结构域的干扰。如果不能满足要求而需要额外再添加氨基酸的话,建议选择结构相对简单的氨基酸,切记避免出现半胱氨酸等含有复杂侧链的氨基酸,否则对蛋白高级结构的形成会造成极大干扰。

    对于你所列的元件顺序,我没有用过,百度表明它是一个慢病毒载体。外源应当接在MCS处,阅读框一直延伸至EGFP止,因而可见荧光强度是能够反映出目的蛋白的表达情况的。而内部的Ubi应该是作为后期蛋白酶酶切所识别的位点,本身就可以作为一个Linker。此时,构建载体的时候就无需考虑中间额外引入氨基酸了,也不需要对下游EGFP的序列进行更改(包括起始密码子的删除),只需要考虑阅读框正确就可以了。

    希望能对你有所帮助!

    实验狗 回答于:2016年08月16日 12:38:146楼

     北京大学 医学部 免疫学 硕士 
    #ACC-CAA-TGG# 在2016-08-15 23:25:50说到:

    一般来说在你所选择插入外源的一对限制性内切酶位点中的下游酶切位点距离报告基因起始本身会多出10-20个碱基,其翻译形成的Linker足够避免相邻结构域的干扰。如果不能满足要求而需要额外再添加氨基酸的话,建议选择结构相对简单的氨基酸,切记避免出现半胱氨酸等含有复杂侧链的氨基酸,否则对蛋白高级结构的形成会造成极大干扰。

    对于你所列的元件顺序,我没有用过,百度表明它是一个慢病毒载体。外源应当接在MCS处,阅读框一直延伸至EGFP止,因而可见荧光强度是能够反映出目的蛋白的表达情况的。而内部的Ubi应该是作为后期蛋白酶酶切所识别的位点,本身就可以作为一个Linker。此时,构建载体的时候就无需考虑中间额外引入氨基酸了,也不需要对下游EGFP的序列进行更改(包括起始密码子的删除),只需要考虑阅读框正确就可以了。

    希望能对你有所帮助!

    正解!连接氨基酸可以考虑甘氨酸等简单的氨基酸,保证两个蛋白连接顺畅不会干扰


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