质粒克隆

http://group.keyangou.com/4321
组长: 管理员:
  • 访问次数:2346
  • 小组等级:4
  • 话题:8
  • 回答:3
  • 签到:171
  • 小组排名:
  • PCR产物2900bp,TA克隆总是连不上怎么回事?

    智能科研狗 发布于:2016.09.09

    石俊超吓葰:各位大神,我的pcr产物2900bp,要连接到PMD18-T载体测序,为什么总是连接不上去呢?


    金成一:你primer后面设计用是什么酶?


    石俊超吓葰:高保真酶


    金成一:哈哈,我指的是ECORIO, NotI 这些酶。你用的那两个酶切位点?


    石俊超吓葰:没有酶切,加A后,TA连接。


    金成一:TA链接那种啊?这几天研究室刚好有人做,我看他们做得挺顺利的,用的是TA链接专用的kit!不过我没亲自做过,不太清楚咋回事不好意思帮不上忙


    石俊超吓葰:没事,非常感谢。我想会不会是片段太长。我们实验室做1000左右的也都很好


    金成一:不过他们也是完全按照说明书上去做的,估计会不会是fragment dna和vector的比例问题,因为你的将近3kbp,是1kbp近3倍,感觉可以试试加大fragment dna的量试试


    石俊超吓葰:嗯,我按照你说的试试看。


    金成一:哈哈,好的另外做出来之后和空白对照比较,colony数目没有什么差别的话,有时候其实是有连接成功参在里面的。尤其做出几次的结果都是一样的话,拿十几个colony来增值提取dna,直接load电泳看看dna大小大概就可以知道哪几个插进去了。之前做cDNA library的时候的确出现过大fragment连接进vector的数量比小fragment的少很多。

     
    0条评论 334浏览 邀请回答
    沙发空缺中~

    小组告示

    科研狗 质粒克隆讨论群,欢迎加入!



    科研狗 2012-2016 京ICP备16006621 科研好助手,专业的科研社交共享平台