质粒克隆

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  • Sal I和Xba I双酶切与甲基化的问题

    智能科研狗 发布于:2016.08.31

    Min: 师兄师姐你们好,这是我酶切位点的序列,中间隔了一个酶,6个碱基,请问这种情况SalⅠ和xbaⅠ双酶切理论上可以切开吗?


    许柏森:应该可以的~只要不是贴得太近


    金成一:理论上可以,实际其实也可以,以前就做过,而且平时DNA构建时,在载体MCS上酶切经常会碰到两个很近的酶切位点,看酶要用的Buf,你SalI和XbaI所用的buf不一样,分别切会比较高效,其他酶切位点如果buf一样,就一起切都问题不大。万一两个酶切位点是连着的,其实也可以切,不过必须分开来切,而且得根据每个酶切完之后端口的碱基数目来决定酶切的先后顺序,那样酶切效率才会比较高!纯属个人经验仅供参考,哈哈


    黄超:@金成一 端口碱基数目和酶切顺序有什么需要遵循的?


    Min: 我刚配完单酶切的体系,不过我不太懂要先切哪个,就随便先切了xbaI


    Jeebnn:你这XbaI有甲基化啊!!!!!非常关键的点,甲基化的话是切不到的


    黄超:怎么看Xbal有甲基化?


    Jeebnn: 根据序列有两种甲基化形式,可以自己去查查。图中XbaI带星号而且灰的,是软件提示甲基化的意思。建议将质粒转化进去甲基化感受态,重新提质粒,酶切制备载体.这是非常关键的点,不然不可能脸上的,全是自连的空载。


    金成一:一个酶切完之后端口的碱基数目离下一个酶切点位置至少至少有三个碱基的距离,也就是昨天群主发的那个链接里说的那样就好。我研究室一个以前的老师说是给酶做落脚点或者说支点,酶才好坐上去切碱基@黄超 


    Jeebnn:需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种:dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化;dcm甲基化酶识别CCWGG位点(W是A或T)并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有:Dpn1(GA/TC)天生就甲基化;Cla1(ATC/GAT)如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你,dam甲基化;Xba1(T/CTAGA)如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化,等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意,避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题,那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化,可以切了。甲基化缺陷型菌有:DM1(Invitrogen)、INV110(invitrogen)、JM110等。


    金成一:我以前切质粒也遇到过类似甲基化,怎么切都切不了,具体为何会出现也搞不清楚。当时是dna片段连上载体后,我们想再切它的时候就不行了,老师说也跟自己用的competent cell有关系,不知是不是真的。

     
    1条评论 708浏览 邀请回答

    智能科研狗 回答于:2016年09月09日 15:21:381楼

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    Min: 给大家反馈一下,上次听了各位大神的意见,我把质粒化转到去甲基化的感受态的细胞,重新提质粒,酶切连接的,现在通过测序验证终于连上了。谢谢


    Min: 哈哈!真的特别感谢群里的各位大家的建议,要不然我估计还没弄明白怎么回事,可能还在死循环中!还有特别多谢群主 @Jeebnn



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